?抗体与免疫荧光标记技术注意要点！
2021/10/18 14:28:53 来源：
自从kohla和milsteinFTTC于1975年首创杂交瘤技术以来，单克隆抗体已应用于免疫学、生理生化、药理学、组织学、肿瘤学、微生物学等不同的学科，其应用之广、发展之快，促使医学、生物学领域起着巨大的变革。单克隆抗体是利用细胞融合技术，在体外大量培养融合细胞，由融合细胞产生大量的抗体。由于单克隆抗体只识别某一特定的抗原决定簇，所以它具有特异性强、成分均一、灵敏度高、产量大、容易标准化生产等优点而明显优于多克隆抗体。目前世界上己建立的单克隆抗体品种数以万计，其中数千种已经上市.
免疫荧光技术又称为荧光抗体染色方法，它是将血清学方法和显微镜示踪方法结合起来的一种技术。这种技术是FTTCcoons等于1942FTTC年首先建立的，在医学和生物学研究工作中的应用将近FTTC%$FTTC多年。荧光抗体法是将特异性抗原多次注入动物体，使之产生抗体，将免疫球蛋白从血清中分离出，用荧光色素标记，制成荧光标记抗体溶液，以该溶液作为特异性试剂，浸染含有特异性抗原（或抗体）的标本，借异抗原抗体的特异性，于抗原或生物学染色方法有较高的特异性和敏感性。由于免疫化学技术的进展和普及，荧光抗体染色法的应用范围也不断扩大。对病原微生物的鉴定、血清抗体的检测、特别是自身免疫病的研究、肿瘤免疫与诊断以及免疫球蛋白的代谢研究均有其优越性。
为了使单克隆抗体所要认识的目标变成可见的诊断目标，那就必须通过把放射性物质、荧光素或酶分子引入抗体等化学修饰手段来达到目的。下面就对单克隆抗体和免疫荧光染色技术的原理、影响因素等方面进行探讨。
1. 基本原理FTTC
FTTC免疫动物脾脏的淋巴细胞即FTTCB淋巴细胞能够产生特异性抗体，含有为抗免疫原抗体编码的基因，但在体外培养条件下生存时间极短。而单个骨髓瘤细胞系虽可在体外长期培养生长，含有提供无限繁殖和分泌免疫球蛋白能力的基因，但其产生的抗体却不具有分泌特异性免疫球蛋白的能力。将这两类细胞融合而产生的杂交瘤细胞，一方面具有骨髓瘤细胞无限生长的能力，另一方面又继承了免疫淋巴细胞的功能，携带特异信息，从而大量合成特异性抗体。
由于细胞融合时，在融合剂聚乙二醇（789）的作用下，只有少数细胞融合而形成杂交瘤细胞，因此必须通过选择性培养基将大量繁殖的未融合细胞分离出来，这就是筛选过程。由于每一个免疫淋巴细胞只能对单一的抗原决定基产生特异性抗体，因此将筛选出的融合细胞通过克隆化，使其集落生长成为单克隆细胞系，就能产生大量单一的高纯度抗体，这种抗体就称为“单克隆抗体”。
1.2FTTC 荧光是染料吸收一种波长的光线，发出更大波长的光线的物理学过程。处于基态的荧光色素受到紫外线或兰紫外线光的照射而吸收足够的能量，而使色素外层电子处于激发态。这种激发态电子给无辐射跃迁到第一能级后则随着进一步的辐射跃迁而回落到基态。在这辐射跃迁的同时释放能量，以可见光的辐射形式释放，这就是荧光。其特征能量（较激发光而言）小而波长长。这是由于部分能量以无辐射形式消耗的缘故，而波长则与能量成反比。
1.3异硫氰酸荧光素（FITC）是目前最为广泛应用的荧光素。在碱性条件下，TITCFTTC分子上的异硫氰基—N=S=CFTTC能与抗体蛋白分子中的游离氨基（主要是赖氨酸的—NH2FTTC和少量的末端氨基）经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，结合为荧光标记抗体蛋白。1个分子的FTTCIgGFTTC有86个赖氨酸，但一般最多只能标记15-20个。因为只有未质子化的自由氨基才能与FTTCTITCFTTC起加成反应。在抗体侧链游离氨基有赖氨酸的—NH2，谷氨酸的胍基，杂环氨基酸———FTTC组氨酸，脯氨酸和色氨酸。其中杂环氨基酸不易与FTTCTITCFTTC反应，而谷氨酸的胍基解离常数（F&FTTC为FTTC!#5FTTC4C）较赖氨酸的—?:#FTTC为小（pkFTTC为10.53"），所以质子化的程度较赖氨酸为高，进而不易与FTTCTITCFTTC反应。
在偏碱性环境条件下赖氨酸之氨基部分未质子化，呈-NH2FTTC状态而易于进行反应。抗体（免疫球蛋白）可以与荧光色素相结合，而不失其抗体的免疫活性，与荧光色素相结合的抗体称为荧光抗体。
利用荧光检测抗体的结合有两种不同的方法。直接免疫荧光采用已直接以荧光染料标记的抗体；而间接免疫荧光测定则是先将未标记的抗体与细胞反应，然后再用荧光染料标记的抗抗体检测这种结合的抗体。抗抗体通常称为第二抗体，是以用于生产单克隆抗体动物的免疫球蛋白免疫异种动物制备的。当用小鼠单克隆抗体进行间接免疫荧光测定时，第二抗体可以是兔抗小鼠免疫球蛋白或山羊抗小鼠免疫球蛋白。
对于大多数用途来说，间接免疫荧光与直接免疫荧光相比具有许多优点，尤其是仅用一种标记的第二抗体即可检测一系列小鼠单克隆抗体。间接法更为敏感，因为增加了被结合分子的数量。但在某些特殊场合下，例如在双标志分析或第二抗体可能与靶细胞上的抗原交叉反应时，则宁可采用直接免疫荧光法。
2，FTTC主要影响因素
免疫荧光染色方法主要是检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。所以对标本的基本要求是抗原的形态变化尽可能地小，不溶解或不变性，原有位置不扩散或不移位。因此，对标本的处理一般速度要快、温度要低，恒冷切片和涂片较为理想。此外，抗体溶液的FTTC-.FTTC和反应温度越低，孵育的时间越长，一般37FTTC时需要15-20min。若要作细致观察或者当天不能进行染色标本的观察，可在FTTC37FTTC中过夜，但染色标本最好是当天观察。
2.1抗体FTTC与多克隆抗体
（即常规血清）比较，单抗具有理化性质的一致性。就是这种单抗的均一性，才体现出其应用价值，但是也存在不利的方面。那就是：在标记反应过程中（包括纯化过程），单抗的失活可能性远大于多抗的失活可能性。单抗愈纯，愈易失活。均一的理化性质，就必然引起标记的均一性。由于抗体与FTTCFTTC的结合势必引起抗体结构的改变，特别是当单抗多变区（属FTTCNH2FTTC端的游离氨基）的结合，就显然影响到抗体抗原的反应，甚至使抗体完全失活。比如PRV-30-2（伪狂犬单抗）的标记过程中，腹水纯化液的FTTC。
另外，必须采用饱和浓度的抗体，以便使荧光量受抗原密度限制，而不受单克隆抗体或第二抗体浓度的限制。通过预滴定几个稀释度的每一单克隆抗体或第二抗体（以肉眼或流动式细胞计数器读数）确定抗体的最适稀释度。当一个稀释度呈现出比前一个稀释度弱的荧光时，抗体便不再处于饱和状态。为了防止该法固有的波动，常规使用的浓度至少应保证在FTTC#FTTC倍稀释度时荧光强度亦不致减弱。高浓度的抗体（如腹水）有时呈现出前带，这一术语用于高浓度的抗体产生阴性反应，而稀释的抗体呈现阳性反应时。在进行免疫荧光测定中，由于有足够的未结合的单克隆抗体与溶液中的标记物反应，从而阻断了标记物于结合与细胞的抗体反应，可能会产生前带。在这种情况下必需洗涤FTTC次。前带可因更复杂的原因而产生，但在免疫荧光测定中不常见。
2.2 温育时间和温度
正像大多数结合—解离平衡一样，低温有助于结合，而高温有利于解离。然而在较高温度下更迅速地达到平衡。因此，获得最大结合的良好方法是先在FTTC37温育，然后将温度降至7FTTC。然而，另一个对温度选择有影响的因素是抗体诱导的膜表面上的抗原移位，这种移位的形式多种多样，如抗原斑片、抗原盖帽、抗原的细胞摄粒作用及抗原脱落，最终可能是抗原丢失（抗原调整），显然，这是应当避免的。在整个试验期间将细胞保持在4FTTC或加叠氮钠，可将这些过程减少到最小限度。由于不能改变温度以适应不同亲和性抗体的需要，可能不得不改变温育时间。对于大多数抗体来说，4温育30min是适宜的，但在这样的条件下，低亲和性的抗体可能达不到平衡，因而需要更长的温育时间。
2.3FTTCPRV-30-2单抗的标记过程
主要是抗体赖氨酸的—氨基的反应。其pk值为10.53，当反应PH愈靠近PK值，非质子化的氨基就愈多，标记上的FTTC就愈多。
特异性染色FTTC非特异性染色主要由于过度标记所引起的，FTTC过多的结合，造成抗体结构的改变，增加了空间位阻，而且，FTTC带负电荷，而病毒的核酸蛋白多为碱性，在染色过程的FTTC-.FTTC均为中性而带正电荷，进而造成静电引力的增加而出现非特异性的吸附。对于单抗而言，过度标记物宁可弃之不用。因为实验表明离子交换层析的流出物之F/P比变化不大，这也说明单抗的理化一致性。
综上所述，我们可以看到单克隆抗体荧光标记技术将成为病毒诊断方面最为快速和准确的方法之一。
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